标准类别 NY/T 农业行业推荐标准
标准名称 日本脑炎病毒抗体间接检测 酶联免疫吸附法 Indirect ELISA for antibody detection of Japanese encephalitis virus
标准分类 养殖业->检疫方法与疾病防治
标准号 NY/T 1873—2010
颁布部门 中华人民共和国农业部
颁布日期 2010-05-20
实施日期 2010-09-01
关键字 日本、脑炎、病毒抗体、间接检测、酶联免疫、吸附法
标准内容
1 范围
本标准规定了日本脑炎病毒抗体的间接ELISA检测技术操作程序。
本标准适用于进出口检疫及流行病学调查时对猪血清中日本脑炎病毒抗体的检测。
2 间接ELISA
2.1 材料准备
2.1.1 器材
37℃恒温培养箱、微量移液器、震荡混匀仪、酶标仪、酶标板等。
2.1.2 包被抗原
包被用琉原为日本脑炎病毒囊膜蛋白结构域Ⅲ重组蛋白(re-DⅢ)，经大肠杆菌表达后亲和层析纯化而成。每孔包被量为100ng。
2.1.3 阴性对照血清
SPF猪血清，经pH 7.4的磷酸盐缓冲液(附录A)1∶40稀释后作为阴性对照血清。
2.1.4 阳性对照血清
日本脑炎病毒疫苗免疫健康猪，抗体中和效价达到1∶640时采血分离血清，将中和效价为1∶640的阳性血清用pH7.4的磷酸盐缓冲液(附录A)作1∶160稀释，即为阳性对照血清。
2.1.5 包被液、洗涤液、封闭液、酶标抗体稀释液、底物液、终止液
配制方法见附录A。
2.1.6 检测前，先将各种试剂材料平衡至室温。
2.2 操作方法
2.2.1 抗原包被
以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗原(将re-DⅢ重组抗原稀释至1μg/mL)，按每孔100μL包被酶标板，37℃作用2h后，洗涤液(PBST)洗板3次，每次5min。
2.2.2 封闭
每孔加入200μL封闭液，37℃封闭2h，洗板同上。
2.2.3 加待检血清及对照血清
以pH7.4的磷酸盐缓冲液作为样本稀释液，将待检血清按1∶40稀释后100μL/孔加样，每板同时设置两孔阴性血清对照、两孔阳性血清对照，并设一孔空白对照。37℃作用1h，洗板同上。
2.2.4 加酶标抗体
每孔加入工作浓度的100μL兔抗猪酶标抗体，37℃作用1h，洗板同上。
2.2.5 加底物液
每孔加入底物液100μL，37℃显色作用10min。
2.2.6 加终止液
每孔加入100μL终止液终止反应，15min之内测定OD450值。
2.2.7 结果判定
在酶标仪上读出OD450的值。以空白值调零，计算阳性对照OD450平均值、阴性对照OD450平均值。
阴性对照OD450平均值≤0.2时试验成立。此时，样品OD450值与阳性对照OD450平均值比值≥0.35判为阳性；样品OD450值与阳性对照OD450平均值比值＜0.35判为阴性。
附录A
(资料性附录)
溶液的配制
A.1 包被液(碳酸盐缓冲液，pH9.6)
NaHCO3(分析纯) 2.98g
Na2CO3(分析纯) 1.5g
定容至1000mL，混匀。
A.2 洗涤液(PBST，pH 7.4)
NaCl(分析纯) 8.0g
KH2PO4(分析纯) 0.2g
Na2HPO4·12H2O(分析纯) 2.9g
KCl(分析纯) 0.2g
Tween20(分析纯) 0.5mL
硫柳汞(分析纯) 0.1g
加双蒸水至1000mL，调至pH7.4。
A.3 封闭液(1%BSA/PBST溶液，pH 7.4)
BSA(生物技术级)5g，加PBST至500mL。
A.4 磷酸盐缓冲液(pH 7.4)
NaCl(分析纯) 8.0g
KH2PO4(分析纯) 0.2g
Na2HPO4·12H2O(分析纯) 2.9g
KCl(分析纯) 0.2g
硫柳汞(分析纯) 0.1g
加双蒸水至1000mL，调至pH7.4。
A.5 酶标抗体稀释液
将小牛血清10mL加入到90mL PBST中，混匀。
A.6 底物缓冲液(TMB-过氧化氢脲溶液)
A.6.1 底物缓冲液A
TMB(生物技术级)200g，无水乙醇(或DMSO)100mL，加双蒸水至1000mL。
A.6.2 底物缓冲液B(0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L Na2HPO4缓冲液，pH 5.0～5.4)
Na2HPO4 14.60g，柠檬酸9.33g，0.75%过氧化氢尿素6.4mL，加双蒸水至1000mL，调至pH5.0～5.4。
A.6.3 将底物缓冲液A和底物缓冲液B按1：1混合即成底物缓冲液。
A.7 底物液
TMB 1mg，1%H2O2 25μL，底物缓冲液10mL，混合即成。
A.8 终止液(2M H2SO4)
将50mL浓H2SO4缓慢滴加入300mL蒸馏水中，边加边搅拌，补充蒸馏水至450mL。
