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昆虫抗真菌肽研究的科学意义及其应用前景

时间:2014-09-26 16:15:57  来源:  作者:杨婉莹; 张 倩; 黄亚东; 温硕洋; 曹 阳

昆虫抗真菌肽(1nsect antifungal pep-tide)及其抗真菌肽基因的研究是近几年国内外偶有报道的一个新的关注点。国内外学者对其给予的重视,首先在于目前对昆虫抗菌肽(Antimicrobial peptide)及其抗菌肽基因的研究已相当深入,并已在植物转基因抗病育种和生物制药开发领域得到利用。但是大多数已报道的昆虫抗菌肽对丝状病原真菌无明显的抑杀作用。所以,如果能从昆虫中发现、分离到既抗细菌又抗真菌的双效抗菌肽因子,不言而喻,这将进一步提高昆虫抗菌肽因子在生物技术领域的应用前景。其次,随着现代医学对人类浅部真菌病,特别是对深部真菌病危害的认识加深,过去用于治疗人浅部真菌病的各种外用药剂,不可能用于人的内脏深部真菌病的治疗。显然,如果能发现具有双效抗性的昆虫抗真菌肽因子,则可能是昆虫抗菌肽研究中更有前途的生物制药开发对象之一。 据此,本文拟就学术界对昆虫抗真菌肽及其基因的研究进展、科学意义和应用前景进行初步讨论,以求获得国内同行和企业对此方向给予更多的支持和参与。

1.昆虫抗真菌肽研究进展简要及其科学意义 1993年Rysuke I等首例报道了由麻绳(Sarcophaga peregrina)3龄幼虫血淋巴分离纯化的AFP(Antifungal protein)抗真菌肽蛋白,它对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌无明显的杀伤作用,但对酵母等真菌Candida albicann(白色假丝酵母菌)、Sac-charomyces cerevisiae(啤酒糖酵母菌)和Shzosaccharomycespombe(粟酒裂殖酵母)存在不同程度的抑制作用。继后不久,SoYoung Lee等于1995年在鞘翅目昆虫东北大黑鳃金龟(Holotrichia dioraphalia)幼虫血淋巴中分离到Holotricin3抗真菌肽蛋白,同样对白色假丝酵母菌(C.albicans)表现出强烈的抑菌效果。研究表明这两类蛋白属于昆虫组成性抗真菌肽蛋白,与昆虫免疫诱导型的抗菌肽有所不同。 对具免疫诱导型的昆虫抗真菌肽因子的发现,几乎同时始于1994年PascaleFehlbaum等人的研究结果。他们用M.1uteus和E.coIi等诱导,由果蝇血淋巴中分离到一个44aa的短肽,被命名为Drosomysin,对其初步的抑菌谱研究结果表明,Drosomysin对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌无抑杀作用,但对8种丝状病原真菌具有很强的抗性。Drosomysin是在昆虫中首次报道的诱导型抗真菌肽。紧接着,Pascale Fehlbaum等又于1996年用E.coli诱导,从斑腹刺益蝽(Podisus mac-uliventris)血淋巴中,发现了既对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌有抑制作用,又对7种病原真菌(包括植物病原真菌和人病原真菌)有强烈抑杀作用的抗真菌肽因子Thanatin。1999年MimiIIe Lambery等同样采用M.Iuteus和E.coli诱导绿棉铃虫(Heliothis virescens,又称烟芽叶蛾)幼虫血淋巴,获得了对丝状病原真菌和酵母菌有较强抑制作用的抗真菌肽因子Helion-micin,但Hdiomicin对革兰氏阴性和阳性细菌却无抑杀作用。笔者等对上述三类新发现的诱导型昆虫抗真菌肽文献进行分析,推测这三种抗真菌肽因子可能都是属于昆虫防御素(Insect defensins)簇的抗菌肽。此外还有关于由黄色粉蛀虫(Tenebriomolitor)发现的Tenecin 3的报道,也是属于诱导型的昆虫抗真菌肽因子。 就目前国外学者已发现的上述6种昆虫抗真菌肽因子大小而言,其氨基酸残基长度为21-194aa,其中最短的Thanatin因子由21aa组成,最长的为Holotricin 3,由104aa组成。曹阳等根据文献分析,发现这些昆虫抗真菌肽因子之间的氨基酸同源性较低,但在其三个功能区的同源性则明显增大。显示具有序列同源的功能进化关系。虽然国外目前对于这些已发现的昆虫抗真菌肽及其基因做了初步研究,包括对其氨基酸组成、理化性质、杀菌谱、同源性,甚至对个别昆虫抗真菌肽因子,例如对Heliomicin(MireiIIe Lambery等,1999)还进行了重组肽的抑菌功能分析,但是有关上述抗真菌肽因子的杀真菌机理等分子生物学问题,特别是它们与昆虫其它抗菌肽,如天蚕素簇杀菌肽(Cecropin family)、昆虫防御素(Insect defensins)、双翅肽(Dipterioin)、蜜蜂肽(Apidaecins)、鞘翅肽(Coleoptericin)的关系等,尚存许多不明晰的地方,有待继续深入研究(MimiHe Lam-bery等,1999)。 昆虫是世界上最丰富的动物类群,其种类达108,个体数量超过106,具有广泛的适应性和较强的生存力。有理由相信,那此生活在潮湿腐生环境完成主要生活周期的昆虫种,应该具备不同方式以抵御真菌病害侵染的机制,其中在昆虫基因组水平上具有的组成性或诱导型昆虫抗真菌肽基因,可能就是其中之一。基于上述理由,华南农业大学蚕学分子生物学与生物技术实验室课题组从1999年秋开始了以筛查、发现新的昆虫抗真菌肽基因为目的的研究工作,先后获得了国家教育部高校骨干教师资助计划、国家自然科学基金和广东省自然科学基金的资助。研究工作已获得了良好进展。课题组首先采用基因片段合成结合PCR扩增方法,人工合成了Thanatin抗真菌肽基因,并将其构建成表达载体pET-21d-出(王艳等,2000,待发表),同时采用嵌合引物分段PCR方法,人工合成了与天蚕素族抗菌肽CAD基因(抗菌肽CecropinAD基因)融合的双价基因,构建成表达载体pET-21d-thCAD(黄亚东,曾锦秀等,2000,待发表),初步的抑菌试验表明,这两种载体分别表达的Thanatin蛋白和Thanatin-CAD融合蛋白对绿色木霉(Trichoderma viride)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)有抑制作用。由基因组水平上筛查新的昆虫抗真菌肽基因的研究也取得重要进展,先后从近40种不同昆虫种的筛查工作中发现,有13种昆虫的基因组中可能含有新的昆虫抗真菌肽基因(张倩、温硕洋等,2001,未发表)。上述工作的继续深入研究,无疑将对今后昆虫抗真菌肽的基础理论研究和拓展应用提供新的内容。 对昆虫抗真菌肽开展广泛的基础理论研究,特别是有关它的生物学、遗传学、分子生物学研究将揭示它与昆虫抗菌肽的功能进化关系,丰富和发展人类对昆虫防御蛋白机制的本质认识,更进一步促进人类对昆虫抗菌肽、抗真菌肽的有效利用。

2 .昆虫抗真菌研究的应用前景 鉴于大多数昆虫抗菌肽对细菌的广谱高效杀灭作用,对某些病毒、癌细胞、原虫也有一定的抑制效果(濯朝阳,1996;黄自然等,1986;韩献萍等,1994;黄亚东等,2000),将昆虫抗菌肽基因导人植物抗病育种研究是近年来非常活跃的领域之一(贾士荣等,1996;田长恩等,2000;李乃坚等,1998;叶志标等,1993;黄大年等,1997;简玉瑜等,1997)。同样,由于昆虫抗菌肽对细菌细胞膜具有穿孔损伤的独特机制,不易使微生物产生抗药性等独特优点(BomaHG,1995),研制开发昆虫抗菌肽作为一类新型生物制剂或药物正在受到人们广泛的重视。但是如前所述,这些昆虫抗菌肽大多数对丝状病原真菌无抑杀效果,因而在昆虫抗菌肽的生物技术应用前景上将始终受到一些限制。显然,广泛深入开展昆虫抗真菌肽及其基因研究,将大幅度拓宽昆虫抗菌肽基因工程、生物技术开发利用的应用前景。 我国已于2001年12月加入WTO,这将意味着目前我国制药行业生产的许多仿制、未经专利授权许可的药品,将停止生产或不得不重新向国外申请专利授权,这是我国医药制药行业进入WTO后面临的严峻问题。因此生产研制具有我国自主知识产权的新药是我国今后面临的一项主要任务。从广泛的昆虫种筛查、鉴定新的昆虫抗真菌肽基因,研制开发具有我国自主知识产权的用于治疗人外部真菌皮肤病和内脏深部真菌病的新药,无疑将具有特殊的意义,对国家、对社会、对企业都将带来巨大的经济效益和国际影响。

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