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A型流感病毒蛋白研究进展

时间:2015-01-14 17:33:21  来源:  作者:刘红旗; 刘秀梵; 张如宽

A型流感病毒是鸟类、人类和低等哺乳动物的严重疾病的病原。Smith等人于1933年首次将从人体中所分离到的流感病毒称之为A型流感病毒。Perroncito记述的1878年意大利爆发的鸡瘟,1955年证实也是由A型流感病毒引起的。20世纪人类流感曾发生过3次瘟疫性的全球大流行:1918-1919年的"西班牙流感"、1957~1958年的"亚洲流感"和1968~1969年的"香港流感",死亡人数达2 000多万。禽流感自1878年在意大利首次发现至今,由于候鸟的迁徙和国际间禽类贸易的日益频繁,使得该病呈全球性分布,给养禽业造成巨大的经济损失,特别是1997年"香港禽流感"事件的发生,更加引起国际科技界的极大关注。许多学者对此病展开了深入广泛的研究,在各个方面取得了很大的进展。现代分子生物学认为:基因作为唯一能够自主复制、永久存在的单位,其生理学功能是以蛋白质的形式表达出来的。本文就A型流感病毒蛋白的结构和功能方面的研究进展作一综述,以期促进对流感的更好的研究和控制。 A型流感病毒是正粘病毒科的重要成员,是8节段的负链单股RNA病毒,共编码10个多肽。节段1和2分别编码多聚酶蛋白PB2和PBl;节段3编码PA蛋白,也与聚合酶活性有关;节段4编码血凝素蛋白HA节段5编码核衣壳蛋白NP;节段6编码神经氨酸酶NA;节段7编码基质蛋白M1、M2和M3(?),可能作为支架蛋白,与病毒的形态有关;节段8编码非结构蛋白NSl和NS2,可能参与病毒基因组的转录,具体情况见表。

1 血凝素蛋白 流感病毒血凝素蛋白(Hemagglutinin,HA)是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分之一,为杆球形蛋白分子,4μm×14μm,在电镜下可形成星状聚合物。HA为75K糖蛋白,是I型膜蛋白。流感病毒的HA包括3个高度保守的半胱氨酸残基。 靠近HA2亚单位羧基端棕榈化位点。功能性的HA是由3个非共价结合的HAl和HA2肽链所组成。 HA首先是作为单一多肽(H0)被合成,两个肽链由二硫键连接在一起。HAl形成HA纤突的球状部分,携带有受体结合位点,该位点的突变有可能改变宿主的特异性,N端有一信号肽,HAl含有毒粒的大部分糖分子,它形成突起的顶端,其寡糖的量占蛋白的20%,是由一些氨基葡萄糖所组成,它通过N-葡萄糖苷链与蛋白的Asp相连合,一些甘露糖则形成枝状结构。此外,还有少量的一种脱氧-岩藻糖(Fucose)。正是由于在病毒的外膜有这些糖类,所以,所有流感病毒对细胞的表面多糖有亲和力,HA通过与细胞表面的唾液酸糖连接区来介导病毒吸附到细胞表面。HA2的N末端有一疏水性的融合肽。HA2的中间部分富含。螺旋,形成HA胞外域的颈。跨膜域和胞浆域位于HA2的C端。在HA2的C端有一疏水区,它是穿膜部分,插入毒粒的双层类脂膜中,在病毒囊膜和细胞膜之间形成一个通道,使两膜融合病毒核酸得以入侵宿主细胞。 HA水解成HAl和HA2,是感染的先决条件,水解后则去除连接肽或单一Arg。这在不同的宿主细胞是不同的。因此,HA对细胞蛋白酶的易感性和这些酶在宿主组织里的分布是病毒泛嗜性的决定因素。最近的研究表明,禽流感和人流感的毒力机制稍有不同:禽诱导下变为具有融合活性的构象。罗汉松酸相关的复合物通过与A型流感病毒的中性pH构象相互作用,可以阻止低pH诱导HA变为融合性构象。胞浆域由10~11个氨基酸组成,其中5个氨基酸残基在A型流感病毒的所有亚型中都是保守的。HA胞浆尾的脂肪酸对孔的形成是必须的。乙酰化位点的减少可阻止HAl亚型感染性病毒的形成。去乙酰化作用不会影响膜的融合和融合孔的形成,但可抑制合胞体的形成。胞浆尾通过干扰脂肪层跨膜域的自由移动来下调融合作用,且其大小和疏水性对这一作用的发挥相当重要。

2 神经氨酸酶 神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)也是流感病毒胞膜的糖蛋白。电镜下,NA突起为10μm长的纤维,在其末端有一个大小不等的较大的结构,其分离物易形成花瓣样结构。每个NA突起为200kDa,它是两个不同的由二硫键连接的55kDa糖蛋白的二聚物,即由4个单体NA所组成,每个单体由一些(-折叠所组成,排列成螺旋桨状,环绕着唾液酸结合位点。NA为Ⅱ型膜蛋白。NA在毒粒的胞膜上似蘑菇状,有一短柄,N'端有一疏水区,它插入毒粒的双层类脂膜,可能也作为信号肽。 NA是一种外切糖苷酶,可裂解唾液酸和附近的糖残基之间的A糖苷键,使子代病毒释放出来,还可防止病毒之间的聚集。正是由于这一作用,0℃发生的血凝现象,在37℃就逐渐逆转,也就是说,在37℃,NA裂解了使病毒赖以组合的细胞膜的受体。但是,目前也有人认为,NA的功能是去除裸露糖蛋白末端的唾液酸,这样可以加速病毒的芽生,使毒粒从受染细胞释放出来,这一作用对感染的扩散,也起重要作用。NA抗体可以抑制酶活性,但不能中和感染力。唾液酸复合物可限制组织培养里的流感病毒的复制。经过进一步修饰的唾液酸可成为流感病毒NA的高亲和性和高特异性的抑制剂。4-鸟嘌啉-2,4-二脱氧-2,3-二脱氢-N-乙酰-神经氨酸(Zanamivir)是唾液酸非饱和类似物,为NA特异性的抑制剂,其鸟嘌啉可以取代唾液酸C4上的羟基。 最新研究表明,NA通过连接和隔离纤维蛋白酶原,提高这种泛在性蛋白酶前体的局部浓度,从而提高HA的裂解性。NA分子的这种不寻常的功能的结构基础是C端的赖氨酸和146位氨基酸残基缺少一寡糖侧链。这些结果表明,对人类来说A型流感病毒(可能其他的一些病毒)都可以通过一种方式变为高致病性。遗传学研究表明,A/WSN/33(H1N10)的NA分子对HA的裂解起关键作用,从而导致病毒的泛嗜性。Lazarowitz等的研究表明,在缺少外源性胰酶的细胞中,血浆纤维蛋白溶酶原是负责WSN的HA裂解的蛋白酶的主要来源。由于NA的C末端有一赖氨酸且其146位氨基酸残基缺少一寡糖侧链,因此,胞浆纤维蛋白溶酶原可以连接到NA上,然后转变为胞浆素,胞浆素可以将HA裂解为HAl和HA2。如果病毒出芽时,细胞缺少胞浆纤维蛋白溶酶原激活剂或者其浓度很低时,那么HA就不能裂解,直到病毒连接到表达适当的胞浆纤维蛋白溶酶原激活剂。

3 核蛋白 核蛋白(Nucleoprotein,NP)是一种单体磷酸化的多肽,分子量约60kDa,它是构成病毒核衣壳的主要蛋白成分。核蛋白具有型特异性,根据其抗原性的不同,可将流感病毒分为A、B、C三型。核蛋白是一种多功能蛋白,除了形成病毒的核衣壳外,在病毒基因组的转录和复制中也可能起作用。核蛋白的磷酸化取决于宿主细胞,与病毒感染的宿主谱有关。核蛋白分子至少具有3个独立的抗原位点,通过用单克隆抗体和多克隆抗体进行研究,发现所有被测毒株中都有一个共同的位点,但针对这一位点的单抗可抑制病毒RNA分子的体外转录。针对核蛋白的单克隆抗体不能给动物提供被动保护,用提纯的核蛋白免疫动物,也只能产生很微弱的抗感染能力,但NP是细胞毒性淋巴细胞识别的主要抗原。

4 聚合酶 流感病毒RNA聚合酶由PBl-PB2-PA三个亚单位构成,参与RNA基因组的转录和复制。亚单位PBl可与核甘酸底物相连,其功能是在病毒mRNA合成起始后使之逐渐延长;在模板RNA和病毒RNA的合成过程中也靠PBl的作用使合成链增长。PBl携带有RNA和DNA聚合酶的保守序列,PBl的SDD序列对RNA的合成是必要的,PBl上还有两个核甘酸结合域。PB2在病毒mRNA转录的起始阶段,识别并结合在5端I型帽状结构;PB2的重要功能是作为一种核酸外切酶可特异性地裂解带帽的mRNAc~。PB2在体外可与I型帽状结构的类似物以及没有PB2且缺少5-帽结构的细胞合成的RNA相连,这些表明PB2对帽状结构的摄取是必要的。PA在病毒RNA转录和复制过程中,与PBl和PB2在一起随链的延长而移动,因此推测PA与PBl和PB2共同构成RNA聚合酶复合体。近来,Nakagawa等的研究表明,PA对依赖cRNA的vRNA的合成是必要的。

5 基质蛋白 流感病毒基质蛋白(Matrix,M)M1是一种多功能因子,其参与病毒生活周期的几个环节,除了作为病毒子的结构蛋白外,M1还有重要的调节功能,如:控制病毒的转录和被感染细胞的胞核胞浆之间的物质运输。这种具有抑制病毒的转录活性的部位位于M1蛋白的氨基端,分别为1-90位氨基酸残基和91~127位氨基酸残基之间。 M1表现为膜连接和RNA连接能力,这两个作用都参与病毒的装配。M1通过直接与RNP核接触来介导抑制流感转录酶的活性。近来报道的M1的原子结构表明,M1与RNA的连接主要通过与91,98,101,102和105位的碱性氨基酸以及聚合结构上的类似物之间的静电相互作用。Watanabe等表明,RNP核抑制转录的活性需要M1上9l一111位氨基酸残基的RNA结合域,这一区域组成了核靶信号(NLS)和M1蛋白的寡聚作用结构域。 A型流感病毒通过膜融合作用进入细胞,病毒核衣壳也进入胞浆,这时M1蛋白从核衣壳分离,M1使RNP复合物运输到基因组转录和复制的部位一-细胞核。在细胞核里,RNP积极地参与转录和复制,分别产生病毒mRNA和子代基因组RNA(vRNA)。病毒感染的后半段时间,通常从感染后4h开始,所有的病毒mRNA的合成急剧减少。这时,为满足子代病毒粒子的装配,聚合酶复合物的生物活性几乎完全转向基因组vRNA的合成。这种转录和复制的解偶联现象是由于M1蛋白的作用。感染后期,M1的积累通过聚合酶复合体来抑制mRNA的合成。从原核生物表达系统纯化的M1可得到同样的结果,尽管其有聚集的倾向。因为体内病毒复制的后期阶段M1的积累可阻止病毒mRNA的产生,所以认为这种抑制作用在体内也存在。M1胞浆池限制新产生的RNP向核运输,而核内的M1则促进RNP从核内输出。对M1功能产生巨大影响的唯一的翻译后化学修饰是磷酸化,可能影响M1的促核内RNP运出的活性D3)。除了这两个主要的M1池外,还有一个次要的M1池,与进入胞浆启动感染的核衣壳有关。将病毒子暴露于内核体的酸性环境里,M1与核衣壳之间的作用发生改变,核衣壳失去M1后就进入细胞核。M1的这种随pH变化而改变其自身结构的能力对其功能的发挥是非常重要的。M1蛋白通过依赖剂量的方式来特异性地抑制流感病毒mRNA的积累。这种抑制活性的部位位于M1蛋白的的氨基端。 M2整合膜蛋白是A型流感病毒子里含量少却很重要的成分,是一个由97个氨基酸残基组成的同寡聚体,由一对二硫键或全部由二硫键相连,形成一单一穿膜结构域,丰富地表达在A型流感病毒感染的细胞表面,病毒子内M2蛋白表达很少。M2蛋白位于膜内,包括由N端24个氨基酸残基组成的胞外区、19个氨基酸残基组成的TM区、54个氨基酸残基组成的胞浆尾。其生物活性式为寡四聚体L14l。四个单体组成离子通道穿孔区。M2蛋白在内核体里的病毒子脱核衣壳时发挥离子通道的作用,促使离子进入病毒子,解除蛋白质之间的相互作用,主要削弱基质蛋白M1与核衣壳蛋白(NP)之间的作用。此外,M2蛋白通过胞吐途径的运输可平衡胞浆和TGN(trans-Goginetwork)腔内的pH值。 M2胞浆尾可能有多种功能,除了维持离子通道活性外,对与病毒子的其他蛋白质之间的相互作用也是很重要的,特别是对M1蛋白。反向遗传学研究表明,M2蛋白胞浆尾被删去5个或10个氨基酸残基后,就会失去拯救流感病毒的能力。然而,尽管失去拯救病毒的能力,离子通道的活性变化和蛋白之间的相互作用没有差别。M2蛋白离子通道活性可被抗流感病毒药物(amantadine)特异性地阻抑,在内核体和TGN腔的低PH环境下又会被激活。

6 非结构蛋白 非结构蛋白(Nonstructure protein,NS)由片段8编码,共编码两种多肽NSl、NS2。 NSl蛋白主要存在于感染细胞的核内。Geenspan等(1988)发现,NSl蛋白含有两个核定位信号区,其中34~38位氨基酸残基处的信号区非常保守,在所有A型流感病毒中都相同,其氨基酸排列顺序为-ASP-ARG-LEU-ARG-ARG-。第二个信号区在203~237位氨基酸残基处,在大多数A型流感病毒中都有这一序列。不同亚型毒株的NSl在带电性和磷酸化方面有很大的差异。 NSl作为IFN的拮抗剂与A型流感病毒的致病性有关。A型流感病毒的高致病性毒株可能是通过NSl蛋白的进化来更加有效地抑制IFN介导的抗病毒效应。NSl可能是通过连接(和隔绝)dsRNA来抑制IFN介导的抗病毒反应。NSl蛋白在体外可通过dsRNA来抑制PKR的激活。缺少NSl基因的流感病毒可能是一种更好的IFN诱生剂,可通过刺激一种抗病毒状态来抵抗各种感染性因子。A型流感病毒NSl蛋白作为一种IFN拮抗剂,可能是将来研究新型抗病毒化合物的好材料。 NS2大量存在于感染细胞中胞浆内,但也可在细胞核内发现,可能在病毒复制过程中起一定的作用,还可能有调节非结构蛋白合成的作用。NS2合成较晚。具体的一些功能还没有彻底搞清楚。

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